前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一種綠藻門小球藻屬的普生性單細胞綠藻，也稱為綠藻，是地球上最早的生命之一，可以稱之為“地球原住民”。蛋白核小球藻體內含有豐富的營養素，包括蛋白質、葉綠素、核酸等，被譽為蛋白質、葉綠素、核酸含量最高的堿性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白質含量可高達50%—70%，遠高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白質含量。它還含有8種必需氨基酸，對人體保持健康、增強體質起到積極的作用。此外，蛋白核小球藻還富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡蘿卜素，這些物質具有較強的抗氧化能力，可以幫助清除機體新陳代謝產生的自由基，從而起到抗衰老的功效。它還富含多不飽和脂肪酸，如亞油酸和γ-亞麻酸等，具有調節血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不僅作為食品和營養補充劑，還在醫藥、化妝品、飼料等領域有著廣泛的應用。
圖1. 蛋白核小球藻
隨著全球人口的增長，對食物的需求也在增加，這加劇了在耕地減少和對傳統肉類生產的倫理擔憂中尋找新蛋白質來源的需求。微藻作為一種有前途的替代蛋白質來源，富含蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸（PUFAs）、維生素和礦物質。然而，在異養培養條件下，由于光合作用依賴的蛋白質合成減少，微藻通常表現出較低的蛋白質含量（<40% 干重），限制了其作為替代蛋白質來源的潛力。為了克服這些挑戰，開發具有天然高蛋白質含量的新型微藻菌株對于通過異養發酵高效大規模生產蛋白質至關重要。
本研究利用常壓室溫等離子體技術（ARTP）對蛋白核小球藻的出發菌株進行突變，產生大規模突變庫，然后基于MISS cell裝備，誘變后的菌液稀釋后上機生成液滴，將細胞（蛋白核小球藻細胞）包裹于液滴中，形成獨立的培養單元，細胞包裹在液滴中培養一段時間，通過檢測OD600將帶菌液滴篩選至多孔板中，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定液滴的蛋白質含量，與出發菌株對比，篩選出高產蛋白質的蛋白核小球藻突變株。
實驗過程
圖2. 蛋白核小球藻的篩選流程
1. ARTP誘變：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）離心去上清，用無菌去離子水洗滌，重復2-3次；最終用1mL 5%甘油重懸。取10μL上述菌懸液涂布與載片上，設置誘變功率120W，誘變時間為15s，開始誘變。誘變結束將載片上的菌液洗脫至EP管內的生理鹽水中。
2. 確定單細胞包裹所需的稀釋度：
通過血球計數板計數，用BG11培養基將誘變后菌株濃度稀釋至500-1000CFU/mL，原始出發菌株濃度稀釋至50-100CFU/mL，工作流程如下：
圖3. 樣本稀釋度確定工作流程
3. MISS cell分離培養：
本實驗誘變后菌株和原始出發菌株共生成5000個液滴，培養10天后進行OD600檢測及分選，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4. MISS cell工作流程
4. 蛋白質含量測定-BCA法：
收集到的目標液滴無需擴大培養直接進行蛋白質含量測定。用生理鹽水將液滴體積補足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做將蛋白標準品對照，60℃孵育30min后用酶標儀進行測定（吸收波長562nm），與出發菌株對比，確定目標液滴蛋白質產量是否增加及增加量。
實驗結果
1. 蛋白核小球藻液滴分選結果
圖5. 原始出發菌株培養10天液滴OD
圖6. 誘變后菌株培養10天液滴OD值
2. BCA法蛋白濃度測定
根據標準曲線計算原始出發菌株和誘變后菌株篩選的液滴蛋白濃度，其中誘變后有2個菌株蛋白濃度高于原始出發菌株，其中3-A8蛋白濃度與原始出發菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
圖7. BSA標準曲線
圖8. 原始出發菌株稀釋103倍培養10天篩選的液滴蛋白濃度
圖9. 誘變菌株稀釋200倍培養10天篩選的液滴蛋白濃度
總結
本研究利用ARTP和MISS cell裝備，將原始出發菌株誘變后進行單細胞包裹，通過OD600分選和BCA法蛋白濃度測定蛋白質含量，篩選出高產蛋白質的蛋白核小球藻突變株，全程高通量、自動化操作，可以直接對液滴進行蛋白質含量測定，避免二次培養的操作，大幅提高了誘變和單克隆篩選的效率，為高產蛋白質的蛋白小球藻選育提供了一種高效的篩選策略。
前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一種綠藻門小球藻屬的普生性單細胞綠藻，也稱為綠藻，是地球上最早的生命之一，可以稱之為“地球原住民”。蛋白核小球藻體內含有豐富的營養素，包括蛋白質、葉綠素、核酸等，被譽為蛋白質、葉綠素、核酸含量最高的堿性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白質含量可高達50%—70%，遠高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白質含量。它還含有8種必需氨基酸，對人體保持健康、增強體質起到積極的作用。此外，蛋白核小球藻還富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡蘿卜素，這些物質具有較強的抗氧化能力，可以幫助清除機體新陳代謝產生的自由基，從而起到抗衰老的功效。它還富含多不飽和脂肪酸，如亞油酸和γ-亞麻酸等，具有調節血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不僅作為食品和營養補充劑，還在醫藥、化妝品、飼料等領域有著廣泛的應用。
圖1. 蛋白核小球藻
隨著全球人口的增長，對食物的需求也在增加，這加劇了在耕地減少和對傳統肉類生產的倫理擔憂中尋找新蛋白質來源的需求。微藻作為一種有前途的替代蛋白質來源，富含蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸（PUFAs）、維生素和礦物質。然而，在異養培養條件下，由于光合作用依賴的蛋白質合成減少，微藻通常表現出較低的蛋白質含量（<40% 干重），限制了其作為替代蛋白質來源的潛力。為了克服這些挑戰，開發具有天然高蛋白質含量的新型微藻菌株對于通過異養發酵高效大規模生產蛋白質至關重要。
本研究利用常壓室溫等離子體技術（ARTP）對蛋白核小球藻的出發菌株進行突變，產生大規模突變庫，然后基于MISS cell裝備，誘變后的菌液稀釋后上機生成液滴，將細胞（蛋白核小球藻細胞）包裹于液滴中，形成獨立的培養單元，細胞包裹在液滴中培養一段時間，通過檢測OD600將帶菌液滴篩選至多孔板中，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定液滴的蛋白質含量，與出發菌株對比，篩選出高產蛋白質的蛋白核小球藻突變株。
實驗過程
圖2. 蛋白核小球藻的篩選流程
1. ARTP誘變：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）離心去上清，用無菌去離子水洗滌，重復2-3次；最終用1mL 5%甘油重懸。取10μL上述菌懸液涂布與載片上，設置誘變功率120W，誘變時間為15s，開始誘變。誘變結束將載片上的菌液洗脫至EP管內的生理鹽水中。
2. 確定單細胞包裹所需的稀釋度：
通過血球計數板計數，用BG11培養基將誘變后菌株濃度稀釋至500-1000CFU/mL，原始出發菌株濃度稀釋至50-100CFU/mL，工作流程如下：
圖3. 樣本稀釋度確定工作流程
3. MISS cell分離培養：
本實驗誘變后菌株和原始出發菌株共生成5000個液滴，培養10天后進行OD600檢測及分選，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4. MISS cell工作流程
4. 蛋白質含量測定-BCA法：
收集到的目標液滴無需擴大培養直接進行蛋白質含量測定。用生理鹽水將液滴體積補足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做將蛋白標準品對照，60℃孵育30min后用酶標儀進行測定（吸收波長562nm），與出發菌株對比，確定目標液滴蛋白質產量是否增加及增加量。
實驗結果
1. 蛋白核小球藻液滴分選結果
圖5. 原始出發菌株培養10天液滴OD
圖6. 誘變后菌株培養10天液滴OD值
2. BCA法蛋白濃度測定
根據標準曲線計算原始出發菌株和誘變后菌株篩選的液滴蛋白濃度，其中誘變后有2個菌株蛋白濃度高于原始出發菌株，其中3-A8蛋白濃度與原始出發菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
圖7. BSA標準曲線
圖8. 原始出發菌株稀釋103倍培養10天篩選的液滴蛋白濃度
圖9. 誘變菌株稀釋200倍培養10天篩選的液滴蛋白濃度
總結
本研究利用ARTP和MISS cell裝備，將原始出發菌株誘變后進行單細胞包裹，通過OD600分選和BCA法蛋白濃度測定蛋白質含量，篩選出高產蛋白質的蛋白核小球藻突變株，全程高通量、自動化操作，可以直接對液滴進行蛋白質含量測定，避免二次培養的操作，大幅提高了誘變和單克隆篩選的效率，為高產蛋白質的蛋白小球藻選育提供了一種高效的篩選策略。
