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天木生物DREM cell成功助力全基因組CRISPRi-微流控篩選,揭示谷氨酸棒桿菌高效分泌蛋白的關(guān)聯(lián)基因

來(lái)源:   作者: 發(fā)布日期:2023-01-04 訪問(wèn)量:6025

本期為您推薦清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)和江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心白仲虎團(tuán)隊(duì)發(fā)表在代謝工程領(lǐng)域國(guó)際知名期刊 Metabolic Engineering 的文章:“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”,論文通訊作者為清華大學(xué)張翀和江南大學(xué)劉秀霞。文章通過(guò)建立全基因組規(guī)模CRISPRi文庫(kù),結(jié)合高通量的分泌蛋白表征技術(shù)和液滴微流控篩選平臺(tái)(DREM cell),在谷氨酸棒桿菌中繪制了蛋白分泌的基因型-表型關(guān)聯(lián)圖譜,系統(tǒng)地揭示了其基因組中能夠用于改善分泌蛋白生產(chǎn)的基因位點(diǎn),并最終指導(dǎo)構(gòu)建了高效分泌重組蛋白的底盤菌株。

001

Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen

谷氨酸棒桿菌因其安全(無(wú)內(nèi)毒素)、高細(xì)胞密度培養(yǎng)和出色的蛋白質(zhì)分泌能力,已廣泛應(yīng)用于重組藥物蛋白的生產(chǎn)。全基因組規(guī)模評(píng)價(jià)有望指導(dǎo)高產(chǎn)重組蛋白的微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建,但由于不僅需要全面的基因型干擾,還需要高通量表型篩選策略,仍存在挑戰(zhàn)。

在這項(xiàng)研究中,研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模的CRISPRi文庫(kù),并開發(fā)了基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)和皮升級(jí)液滴微流控分選平臺(tái)(DREM cell)的重組蛋白高通量篩選模型,通量可達(dá)到>105個(gè)單細(xì)胞/天。

002

Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets

以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白,使用建立的模型對(duì)文庫(kù)中超過(guò)50萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行高通量篩選,通過(guò)多輪篩選富集了大量高產(chǎn)菌株。許多以前未知的基因被確定為在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用的有益靶點(diǎn),包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝和氧化還原調(diào)節(jié)。通過(guò)氧還轉(zhuǎn)錄因子 CosR RshA 的組合敲除獲得了VHH產(chǎn)量提高2.78倍的底盤菌株。

由于 CRISPR 技術(shù)和基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)的液滴微流控篩選平臺(tái)的普適性,該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺(tái)未來(lái)或被廣泛應(yīng)用于各種原核宿主和不同蛋白的分析,助力下一代微生物蛋白細(xì)胞工廠的創(chuàng)制。

003

Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains

004

Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins

論文鏈接:

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004



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Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen

谷氨酸棒桿菌因其安全(無(wú)內(nèi)毒素)、高細(xì)胞密度培養(yǎng)和出色的蛋白質(zhì)分泌能力,已廣泛應(yīng)用于重組藥物蛋白的生產(chǎn)。全基因組規(guī)模評(píng)價(jià)有望指導(dǎo)高產(chǎn)重組蛋白的微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建,但由于不僅需要全面的基因型干擾,還需要高通量表型篩選策略,仍存在挑戰(zhàn)。

在這項(xiàng)研究中,研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模的CRISPRi文庫(kù),并開發(fā)了基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)和皮升級(jí)液滴微流控分選平臺(tái)(DREM cell)的重組蛋白高通量篩選模型,通量可達(dá)到>105個(gè)單細(xì)胞/天。

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Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets

以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白,使用建立的模型對(duì)文庫(kù)中超過(guò)50萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行高通量篩選,通過(guò)多輪篩選富集了大量高產(chǎn)菌株。許多以前未知的基因被確定為在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用的有益靶點(diǎn),包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝和氧化還原調(diào)節(jié)。通過(guò)氧還轉(zhuǎn)錄因子 CosR RshA 的組合敲除獲得了VHH產(chǎn)量提高2.78倍的底盤菌株。

由于 CRISPR 技術(shù)和基于雙砷-四半胱氨酸反應(yīng)的液滴微流控篩選平臺(tái)的普適性,該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺(tái)未來(lái)或被廣泛應(yīng)用于各種原核宿主和不同蛋白的分析,助力下一代微生物蛋白細(xì)胞工廠的創(chuàng)制。

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Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains

004

Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins

論文鏈接:

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004



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